Análise genética

Análise genética do ADN: compreender o teste de ADN, polimorfismos e fiabilidade dos resultados

O teste de ADN é uma técnica de análise genética que permite identificar uma pessoa (ou comparar várias pessoas) a partir de uma pequena quantidade de amostra biológica.

O princípio é simples:

• os humanos partilham uma parte muito grande do seu ADN,

• mas cada indivíduo possui também uma parte do seu ADN que é única, formando uma impressão digital genética.

Para compreender como um laboratório estabelece este perfil genético, devemos voltar aos fundamentos: o que é o ADN, como está organizado, e que regiões são utilizadas para comparar dois perfis.

O que é o ADN? (definição simples)

O ADN é uma longa molécula que contém as instruções necessárias para o funcionamento do organismo.

Nas nossas células, o ADN está enrolado e condensado no núcleo sob a forma de "novelos de lã" chamados cromossomas.

Cada pessoa tem 46 cromossomas por célula:

• 23 herdados da mãe biológica,

• 23 herdados do pai.

O ADN gere uma grande parte das nossas funções biológicas. É o portador da informação genética, e serve de plano para a fabricação de muitas moléculas essenciais.

Composição do ADN: nucleótidos, aminoácidos e proteínas

Nucleótidos (A, C, G, T)

Ao nível de base, o ADN é composto por nucleótidos. Estes são componentes orgânicos (formados a partir de elementos químicos) que se montam em sequências.

Existem 4 nucleótidos, representados por:

• A (Adenina)

• C (Citosina)

• G (Guanina)

• T (Timina)

Do ADN às proteínas

No organismo, a informação codificada pelo ADN é utilizada particularmente para produzir proteínas.

Em termos simplificados:

• sequências de nucleótidos permitem formar estruturas mais complexas,

• estas estruturas levam à formação de aminoácidos,

• depois os aminoácidos montam-se para formar proteínas.

As proteínas têm numerosas funções: participam na criação de moléculas, na gestão de funções vitais e na transmissão de informação. Consoante a sua função, podem ter diferentes nomes (enzimas, miosina, histonas, etc.).

Genes: regiões codificantes, regiões não-codificantes, e o conceito de locus

ADN em dupla hélice e regras de emparelhamento

O ADN está organizado como uma dupla hélice: duas longas cadeias paralelas e complementares de nucleótidos, ligadas por ligações moleculares.

As bases emparelham-se sempre rigorosamente:

• G está sempre oposto a C (e vice-versa),

• A está sempre oposto a T (e vice-versa).

Esta organização torna a duplicação do ADN mais fácil e mais fiável.

O que é um gene?

Um gene é um segmento de ADN. Consoante a sua expressão, contribui para a função da célula (célula cardíaca, célula hepática, célula cerebral, etc.).

Geralmente distinguimos:

• regiões codificantes, utilizadas para produzir novas proteínas,

• regiões não-codificantes, que desempenham principalmente um papel regulador.

Considera-se que as regiões não-codificantes representam aproximadamente 98% do nosso ADN.

Locus: localizar uma região precisa do ADN

Os genes e certas sequências estão posicionados em locais precisos no ADN. Esta posição é estável em todos os seres humanos, o que facilita a localização.

Quando se localiza uma região precisa, fala-se de um locus.

• Numa região codificante, o locus pode ser identificado pela proteína associada.

• Numa região não-codificante, o locus é frequentemente nomeado segundo um código padrão.

Exemplo: D18S52

• 18: cromossoma 18

• S: sequência única (no sentido de marcador)

• 52: número do locus

Polimorfismos: porque cada ADN é diferente

Mesmo que todos pertençamos à mesma espécie, a nossa diversidade provém de pequenas variações no ADN.

Estas variações chamam-se polimorfismos. Quando se comparam dois indivíduos selecionados aleatoriamente, encontra-se aproximadamente 1 variação por 1.200 nucleótidos.

Dois tipos de polimorfismos (segundo a região)

Existem dois casos principais:

• variação em região codificante: a variação pode afetar a proteína.

• variação em região não-codificante: a variação é frequentemente observável pelo número de repetições de uma sequência. Fala-se então de polimorfismo de comprimento.

Polimorfismo de comprimento e o conceito de alelo

O polimorfismo de comprimento corresponde a uma sequência repetida várias vezes.

Exemplo (sequência repetitiva): AAGTA

• 11 repetições numa pessoa,

• 14 repetições noutra,

• 15 repetições numa terceira.

O termo utilizado para designar uma variante é alelo.

Durante uma análise, uma pessoa tem geralmente dois alelos para uma característica genética:

• um alelo do cromossoma paterno,

• um alelo do cromossoma materno.

Sequências repetitivas: VNTR e STR (os marcadores mais utilizados)

Uma sequência polimórfica repetida é classificada segundo o seu comprimento:

• VNTR (Variable Number Tandem Repeats), ou minissatélites: repetições de sequências de pelo menos 10 nucleótidos.

• STR (Short Tandem Repeat), ou microssatélites: repetições de sequências curtas, de menos de 10 nucleótidos.

Os STR estabeleceram-se na análise genética por várias razões:

• são muito numerosos (aproximadamente 50.000 sequências STR no ADN humano),

• podem ser analisados em multiplex (vários marcadores ao mesmo tempo).

No entanto, consoante os marcadores, podem por vezes apresentar polimorfismo mais limitado.

Como é realizada a análise de ADN no laboratório?

O objetivo do laboratório é obter um perfil utilizável, depois comparar marcadores genéticos para estabelecer uma impressão digital genética.

1) Extração e purificação do ADN

O primeiro passo consiste em extrair e purificar o ADN.

A ideia é separar o ADN de outras substâncias que poderiam dificultar a análise. Para isso, a amostra é colocada num meio que elimina elementos externos para preservar apenas a molécula de ADN.

Consoante o tipo de análise, sequências (frequentemente STR) podem ser selecionadas e cortadas com enzimas de restrição.

As enzimas de restrição são proteínas (frequentemente de origem bacteriana) capazes de cortar o ADN em sequências específicas. São amplamente utilizadas em engenharia genética e em laboratórios.

2) Amplificação por PCR (Polymerase Chain Reaction)

O segundo passo é a amplificação por PCR. Esta técnica permite, a partir de uma amostra escassa, a cópia rápida de sequências de ADN visadas num grande número de cópias.

Isto é possível graças a uma enzima: a ADN polimerase, que reconstrói o ADN a partir de uma hélice previamente separada.

A mistura de PCR compreende geralmente:

• amostra de ADN (sequência alvo),

• nucleótidos adicionais,

• primers (pequenas cadeias complementares à sequência a copiar),

• ADN polimerase.

A mistura é submetida a ciclos de temperatura:

• desnaturação (aproximadamente 90°C): separação das duas cadeias,

• hibridização (aproximadamente 45°C): fixação dos primers,

• elongação (aproximadamente 72°C): reconstrução da cadeia em falta.

A cada ciclo, o número de cópias duplica. Em 30 a 40 ciclos, obtêm-se milhões de cópias da sequência alvo.

3) Eletroforese: separação de fragmentos e leitura do perfil

O terceiro passo é a eletroforese, que permite separar fragmentos segundo o seu tamanho sob o efeito de um campo elétrico.

Sendo o ADN negativamente carregado, os fragmentos migram em direção ao polo positivo.

• quanto menor for um fragmento, mais rapidamente e longe migra,

• fragmentos do mesmo tamanho formam bandas identificáveis.

Graças a esta leitura, o laboratório pode determinar a composição do fragmento: o número de nucleótidos e o número de repetições.

O conjunto dos resultados forma a impressão digital genética de uma pessoa, que pode depois ser comparada para determinar uma ligação de filiação.

Com exceção dos gémeos verdadeiros, a probabilidade de que duas pessoas tenham a mesma impressão digital genética é extremamente baixa (aproximadamente 1 em 3 mil milhões).

Análise do ADN mitocondrial (ADNmt): um teste não padrão

O teste de ADN mitocondrial (ADNmt) é uma análise genética que não se baseia no ADN nuclear (aquele contido no núcleo), mas no ADN presente nas mitocôndrias.

Mitocôndrias: para que servem?

As mitocôndrias são estruturas especializadas (organelos) que produzem energia para a célula.

Considera-se que têm origem em antigas bactérias que entraram em simbiose com uma célula há vários milhões de anos.

Porque o ADNmt é particular?

O ADN mitocondrial:

• é circular,

• está presente em cópias muito numerosas (várias centenas de mitocôndrias por célula, com várias cópias de ADN cada),

• pode ser isolado de amostras antigas ou degradadas, onde o ADN nuclear não é detetável.

Transmissão materna do ADNmt

O ADN mitocondrial transmite-se pela linhagem materna: durante a fecundação, o óvulo fornece as mitocôndrias.

Assim, os membros de uma fratria partilham geralmente o mesmo ADN mitocondrial transmitido pela mãe, ela própria tendo-o herdado da sua mãe, e assim por diante pela linhagem materna.

O ADNmt nem sempre identifica um indivíduo a 100% (várias pessoas podem partilhar ADNmt idêntico), mas pode ser útil para:

• verificar uma ligação de parentesco,

• explorar certas origens,

• analisar amostras degradadas.

Mutações aparecem por vezes ao longo das gerações. A sua acumulação explica porque

linhagens maternas distintas apresentam eventualmente ADNmt diferentes.

Qual é a fiabilidade de um teste de ADN?

A fiabilidade de um teste de ADN depende de vários fatores.

1) Acreditação do laboratório

Verificar a acreditação do laboratório assegura os métodos de análise utilizados e a seriedade do controlo de qualidade.

A acreditação corresponde a uma norma internacional que o laboratório pode obter após verificação do processo por um organismo externo.

Pode também ser importante se procura um nível de reconhecimento legal consoante o contexto.

2) Declaração da sua situação

Antes de encomendar, descreva claramente a situação familiar, dúvidas e possíveis relações entre participantes.

O resultado depende também da boa compreensão do contexto, pois a interpretação baseia-se em cálculos de probabilidade.

3) Tipo de teste

Nem todos os testes de ADN são iguais consoante a situação.

Regra geral, é aconselhável realizar o teste com a pessoa diretamente em causa, pois isto aumenta a pertinência e fiabilidade da comparação.

4) Tipo de amostra

A fiabilidade não depende apenas do tipo de amostra, mas nem todas as amostras fornecem sempre informação genética suficiente de forma fiável.

Uma amostra bem recolhida e conservada facilita muito a análise.